El microscopio de epifluorescencia es un microscopio óptico. En un microscopio óptico convencional la luz atraviesa la muestra estudiada, mientras que en un microscopio de epifluorescencia la luz que incide sobre la muestra estudiada no la atraviesa sino que el mismo lente ilumina y recibe la luz emitida por la muestra. Su funcionamiento se basa en la propiedad de fluorescencia que tienen ciertas moléculas denominadas fluorocromos.

Los fluorocromos son sustancias que tienen la propiedad de emitir un fotón de una longitud de onda determinada cuando son excitados por un fotón incidente de una longitud de onda característica. La parte de la molécula que emite la fluorescencia se denomina fluoróforo. Las moléculas de fluorocromo se utilizan para marcar ciertas estructuras celulares destacándolas del resto de los elementos que componen la célula. Esto permite identificar distintas moléculas o conjuntos de moléculas. El fluorocromo puede tener afinidad por distintos elementos celulares o puede ser acoplado químicamente a otras moléculas como anticuerpos que reconocen específicamente cierto componente celular.

Figura 4 - Fluoróforo "Stokes shift"

En el pasaje de los electrones del estado excitado al estado estable se pierde energía. Como resultado el espectro de emisión de un fluoróforo excitado se corre hacia una longitud de onda mayor en relación al espectro de excitación. Es lo que se denomina "Stokes shift".

Figura 5 - Esquema de funcionamiento

En la figura 5 se observa un esquema de funcionamiento del microscopio de epifluorescencia. La luz procedente de la fuente (lámpara de mercurio o xenón), atraviesa un primer filtro que selecciona la longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo, antes de incidir sobre la muestra. Esta luz se refleja en un espejo dicromático (o dicroico) e incide sobre la muestra, excitando al fluorocromo, el que emite fotones de una longitud de onda mayor que la incidente. La luz emitida por la muestra no se refleja sino que atraviesa el espejo dicroico y llega a un segundo filtro que selecciona la longitud de onda de emisión del fluorocromo. Finalmente, la luz ingresa a un fotomultiplicador que la convierte en una señal eléctrica.