Fluorescencia | Microscopía Fluorescente

PALABRAS CLAVE: Fluoróforo, epí-fluorescencia, filtros fluorescentes, confocal, GFP, PA-GFF, Kaede, puntos cuánticos, imagen espectral, FLIM, FRAP, FLIM, FLIP, TIRF, pinzas láser, imagen multidimensional, episcópica, diascópica, resolución, cociente señal a ruido,  tecnología “eliminador de ruido”

DEFINICIÓN:

La fluorescencia es el fenómeno donde la absorción de luz de una longitud de onda dada por una molécula es seguida por la emisión a longitudes de onda más largas (visible).

TECNOLOGÍA:

La imagen fluorescente usa iluminación de alta intensidad para excitar moléculas fluorescentes en la muestra. Cuando una molécula absorbe fotones, los electrones son excitados a un nivel de energía más alto. Conforme los electrones se “relejan” a su estado cero, se pierde la energía vibracional y, como resultado, el espectro de emisión se mueve a longitudes de onda más largas.

La fluorescencia que emana desde la muestra (y no la luz iluminante). En los microscopios de epí-fluorescencia, el objetivo enfoca tanto la luz de excitación como colecta la luz que regresa al ocular o detector. La fluorescencia se separa de la lul de excitación por un espejo dicroico y los filtros apropiados: la luz de excitación se refleja de regreso dentro del objetivo mientras que se transmite la fluorescencia. Los filtros, excluyendo y/o transmitiendo longitudes de onda de luz seleccionadas, optimiza fluorescencia y reduce el “ruido de fondo” no deseado.

Varias sustancias autofluorescen y esto has sido explotado especialmente en botánica, petrología, y la industria de semiconductores. Los fluoróforo disponibles comercialmente, con espectros de excitación y emisión bien definidos, se pueden usar para “manchar” estructuras específicas o moléculas en un espécimen. La elección juiciosa de fluoróforos permiten la identificación de varios objetivos mientras que los espectros de emisión se pueden separar limpiamente y distinguirse de la auto fluorescencia.

APLICACIONES:

La obtención de imágenes auto fluorescentes permite visualizar moléculas que están más allá del límite de resolución de la microscopia de luz. La microscopia fluorescente es una técnica clave en el diagnóstico clínico (por ejemplo, inmunología, patología, microbiología, citogenética) y ambientes de investigación. La microscopia fluorescente confocal, en particular, se ha vuelto una herramienta esencial para estudiar las dinámicas estructurales y moleculares en células vivas. La fluorescencia habilita técnicas de imagen como el TIRF, FRET, FLIM, FLIP y FRAP. La microscopia de fluorescencia también es importante para identificar minerales fluorescentes, contaminantes e impurezas en ciencias de materiales, geología, inspección de semiconductores, y protección ambiental.

CONFIGURACIÓN DEL MICROSCOPIO:

La imagen fluorescente se puede realizar en casi cualquier microscopio Nikon vertical, invertido, de polarización o estereoscópico con la iluminación apropiada (episcópica o diascópica) y filtros (excluye a los microscopios Coolscope y estereoscópico SMZ6). La obtención de imágenes fluorescentes también se puede realizar en los sistemas de incubación e imagen de Nikon BioStation. Los microscopios invertidos se pueden configurar con aplicaciones basadas en láser como PA-GFP, pinzas láser y FRAP. La resolución en la imagen fluorescente se mejora con el uso del microscopio confocal (sistemas Nikon EC1, C1, C1si y LiveScan Sweptfield). Esto elimina la luz sobre y bajo el plano de foco para reducir dramáticamente lo borroso. El sistema de imagen confocal C1si permite la separación de espectros que se sobreponen. Las series invertidas Nikon Ti y Eclipse-i de microscopios biológicos verticales incluyen la tecnología eliminadora de ruido para mejorar los cocientes señal entre ruido. Varios objetivos especializados para fluorescencia están disponibles (Plan Fluor, Súper Fluor, Plan Apocromáticos, Plan Apocromáticos VC). Para aplicaciones industriales, Nikon recomienda el Eclipse 90i y el sistema DIH-E.

SISTEMA SOLUCIÓN:

La elección del sistema fluorescente dependerá de la aplicación. Consulte a Nikon para consejos.

LIGAS

Fluorescencia: [microscopyu]
Filtros: [microscopyu]
Microscopía fluorescente en  estereomicroscopios: [microscopyu]