Función del sistema plasminógeno-plasmina en la fecundación de ovocitos bovinos y porcinos

• Autores: Luis Alberto Grullon Yunen
• Directores de la Tesis: María Pilar Coy Fuster (dir. tes.), Raquel Romar Andrés (dir. tes.)
• Lectura: En la Universidad de Murcia ( España ) en 2010
• Idioma: español
• Tribunal Calificador de la Tesis: Ignacio Santiago Álvarez Miguel (presid.), Sebastián Cánovas Bernabé (secret.), Joaquin Gadea (voc.), Manuel Avilés Sánchez (voc.), Patricia Grasa (voc.)
• Materias:
  • Ciencias agrarias
    • Ciencias veterinarias
      • Fisiología
• Enlaces
  • Tesis en acceso abierto en: DIGITUM
• Resumen

  • El sistema plasminógeno-plasmina (PLG-PLA), más conocido como sistema fibrinolítico por su papel en la disolución de los coágulos sanguíneos, está implicado en procesos de remodelación tisular y migración celular, tales como la invasión de los tejidos circundantes por las células patógenas o tumorales (Danø et al., 1985; Ossowski et al., 1973), la angiogénesis (Rifkin et al., 1983) o la invasión del endometrio por el trofoblasto (Sappino et al., 1989; Strickland et al., 1976). Se trata de un imbricado sistema en el que participan distintos activadores e inhibidores que a su vez forman parte de diferentes cascadas de señalización intracelular (Binder et al., 2007). El sistema tiene como componente central al plasminógeno (PLG), sintetizado en forma de zimógeno inactivo principalmente en el hígado (Raum et al., 1980), aunque también se ha descrito en otros lugares como los túbulos seminíferos (Saksela y Vihko, 1986). El PLG se activa transformándose en plasmina (PLA) por rotura de un enlace peptídico sencillo gracias a la acción de alguno de sus dos activadores, el activador del plasminógeno tipo tisular (tPA) o el activador del plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), ambos pertenecientes a la familia de las serín proteasas. El tPA es sintetizado principalmente por las células endoteliales (Danø et al., 1985) y abunda en el plasma de la especie humana (Collen, 1987). Se han descrito receptores para tPA en la superficie de numerosos tipos celulares implicados en diversas funciones. La mayoría de estos receptores unen también PLG, favoreciendo la formación de PLA más eficientemente y de forma focalizada sobre la superficie celular. De esta forma contribuyen a la regulación de la fibrinolisis así como a la degradación de otras proteínas tanto de la membrana como de la matriz extracelular (ECM). El uPA, por su parte, es una proteína secretada por las células endoteliales y epiteliales principalmente en los conductos excretores del organismo (como los túbulos renales) y fue descrito inicialmente en cultivos de células de carcinoma ovárico (Astedt y Holmberg, 1976). La unión de uPA a su receptor de membrana, uPAR, aumenta sus efectos biológicos, sean éstos dependientes o no de la proteólisis (Andreasen et al., 1997; Sabapathy et al., 1997; Shapiro et al., 1996). Una vez formada la PLA por la activación del PLG, ésta ejerce su efecto proteolítico asociado a la superficie celular y en la sangre degrada con gran eficacia la fibrina (Collen y Lijnen, 1995). Además, la PLA se une a una gran variedad de sustratos y es capaz de degradar diferentes moléculas que forman parte de la matriz extracelular (ECM) y de la membrana basal, tales como la fibronectina, laminina, vitronectina, proteoglicanos y colágeno (Aguilar et al., 2004; Irigoyen et al., 1999). La actividad proteolítica de todo este sistema está controlada, principalmente, por inhibidores de los activadores del plasminógeno (PAIs). Estos inhibidores pertenecen a la familia de las serpinas (inhibidores de serín proteasas) y se conocen tres tipos, PAI-1, PAI-2 y PAI-3. En el aparato reproductor, uno de los aspectos más estudiados del sistema PLG-PLA ha sido su relación con la ovulación, ya que contribuye a la degradación proteolítica de la pared folicular para permitir la salida del complejo cumulus-ovocito (revisado por Liu, 2004). También se ha demostrado su relación con la dispersión de la células del cumulus (D'Alessandris et al., 2001), la espermatogénesis (Clermont, 1972; Vihko et al., 1984), la motilidad espermática y la reacción acrosómica (Hong et al., 1985; Taitzoglou et al., 2003; Taitzoglou et al., 2004) o la implantación (Fazleabas et al., 1983; Finlay et al., 1983). Sin embargo, la relación del sistema PLG-PLA con la fecundación no está hoy día clarificada. Aunque a lo largo de los años se ha podido demostrar la presencia de algunos de los componentes del sistema PLG-PLA en los gametos (Huarte et al., 1987a; Huarte et al., 1985) y en el oviducto de los mamíferos (Kouba et al., 2000a) el papel concreto que juega este sistema en la fecundación, si es que juega alguno, está por determinar. Por ello, el objetivo principal del presente trabajo consistió en averiguar si el sistema PLG-PLA afecta al proceso de fecundación y, en el caso de que así fuera, identificar los componentes del sistema que participan en dicho efecto y el mecanismo mediante el que actúan. En la primera parte de nuestro trabajo experimental decidimos emplear la técnica de fecundación in vitro (FIV) para estudiar el efecto del PLG y la PLA sobre el proceso de fecundación, ya que ésta es la herramienta disponible que más nos aproxima a la fecundación fisiológica. Como modelos experimentales elegimos el bovino y el porcino. Ambos son muy diferentes en cuanto a rendimiento en FIV ya que, mientras que en el primero, el número de espermatozoides que penetran cada ovocito suele estar próximo a uno, el segundo se caracteriza por el alto índice de penetraciones polispérmicas que se obtienen cuando se utiliza la FIV (Coy et al., 2008a). Por ello, decidimos emplear ambos modelos paralelamente en aquellos casos en los que el experimento pudiera ofrecer alguna duda en relación a que el efecto observado pudiera depender del número de espermatozoides que penetraran cada ovocito. A partir de ovarios recogidos en matadero, se procedió a la obtención y maduración in vitro de ovocitos bovinos y porcinos. Estos ovocitos fueron fecundados in vitro con espermatozoides de toros y verracos de fertilidad probada que se sometieron previamente a un proceso de selección mediante gradientes de densidad. Empleando PLG añadido al medio de cultivo, se realizaron estudios dosis-efecto (distintas concentraciones de PLG) y tiempo-efecto (PLG añadido 30 minutos antes, 30 minutos después, o al mismo tiempo que se añadían los espermatozoides al medio que contenía los ovocitos) durante la FIV bovina y porcina. Se evaluaron los resultados a las 18-20 horas del inicio del cultivo. Se comprobó que la adición de PLG al medio dificultaba, en términos generales, la entrada de espermatozoides al interior de los ovocitos y disminuía el número de espermatozoides que permanecían adheridos a la ZP tras ese tiempo. Este efecto era más marcado si se adicionaba el PLG 30 minutos después de añadir los espermatozoides a la placa que contenía los ovocitos que si se adicionaba 30 minutos antes. Además, el efecto era más evidente cuanto mayor era la dosis de PLG ensayada, y semejante al provocado cuando se adicionaba directamente PLA en concentraciones similares. Por lo tanto, dedujimos que el PLG que nosotros añadíamos al medio se estaba activando a PLA en nuestras condiciones de trabajo y que ésta era, en último término, la responsable del efecto observado. Dado que en el medio de cultivo empleado para la FIV no se había añadido ningún activador del PLG, llegamos a la conclusión de que dichos activadores debían proceder necesariamente de los gametos y que debían liberarse durante el tiempo que permanecían en cultivo. Una vez comprobamos que el sistema PLG-PLA tenía un papel en la fecundación, en la segunda parte de este estudio se emplearon técnicas de inmunofluorescencia indirecta para detectar la presencia de PLG y de sus activadores (tPA y uPA) en los ovocitos bovinos y porcinos. No se intentaron detectar dichos activadores en los espermatozoides porque ya existen suficientes estudios previos que los han evidenciado (Huarte et al., 1987a; Smokovitis et al., 1992). Sin embargo, en el caso del ovocito, sólo habíamos encontrado dos referencias en la bibliografía en las que se había detectado su relación con el PLG: una en el ratón, en el que Huarte et al. (Huarte et al., 1993) demostraron que los ovocitos eran capaces de unir moléculas de PLG, y otra en el hámster, en el que Jiménez Díaz et al. (Jimenez-Diaz et al., 2002) detectaron la presencia de PLG en ZP y membrana de ovocitos por técnicas de inmunofluorescencia indirecta. Para la detección del PLG en los ovocitos se usó una técnica indirecta en dos capas, empleando un anticuerpo comercial policlonal anti-PLG producido en conejo como anticuerpo primario y un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado a TRITC (isotiocianato de tetrametil rodamina) para poder visualizar el marcaje obtenido en el microscopio confocal. Para la detección de los dos activadores del plasminógeno se utilizó también inmunofluorescencia indirecta pero en este caso en tres capas. Se emplearon anticuerpos comerciales policlonales anti-tPA y anti-uPA producidos en cabra como anticuerpos primarios. Posteriormente se empleó un anticuerpo secundario anti-cabra producido en conejo y un anticuerpo terciario anti-conejo conjugado de nuevo a TRITC. Los resultados obtenidos demostraron que el PLG se localiza en la ZP y en las proximidades del oolema de los ovocitos bovinos y porcinos, y que tanto tPA como uPA están presentes en ambas localizaciones antes de la fecundación. Sin embargo, una vez fecundados, los ovocitos pierden prácticamente todo el PLG y gran parte de la señal de los activadores en las cercanías del oolema. En la ZP, también la señal para el PLG y sus activadores disminuye tras la fecundación, quedando circunscrita normalmente a los sitios donde se observan espermatozoides unidos. Estos resultados indicaban que el sistema, de alguna manera, se debía activar durante el proceso de interacción espermatozoide-ovocito y provocar el efecto que habíamos observado en la primera parte del estudio, aunque quedaba por averiguar de qué modo ejercía tal efecto. Por ello, en la tercera parte del presente trabajo se realizaron diversos experimentos con el fin de describir, al menos parcialmente, el mecanismo por el cual el sistema PLG-PLA provocaba el efecto observado en la fecundación. Para evaluar si este sistema, como se había sugerido (Zhang et al., 1992) estaba implicado en el endurecimiento de la ZP post-fecundación descrito en el ratón (Moller y Wassarman, 1989) procedimos a incubar los ovocitos bovinos y porcinos en presencia o ausencia de PLG y de PLA. El endurecimiento post-fecundación se refiere al incremento de la resistencia de la ZP a la digestión en pronasa y a la penetración espermática que se observa tras la fecundación, al menos en el ratón (Moller y Wassarman, 1989). Tras la incubación, evaluamos la resistencia de las ZPs a ser digeridas en una solución de pronasa, observando que ni el PLG ni la PLA afectan a esta propiedad de la ZP. Por lo tanto, su posible papel en el endurecimiento post-fecundación de la ZP fue descartado. Empleando técnicas de citometría de flujo, procedimos a evaluar tres parámetros relacionados con la funcionalidad espermática como son la viabilidad, la estabilidad del acrosoma y el grado de desorden lipídico de las membranas. El estado del acrosoma se evaluó mediante una tinción simultánea con la lectina Arachis hypogaea agglutinin unida a isotiocianato de fluoresceína (PNA-FITC) y yoduro de propidio (IP). En cuanto al grado de desorden lipídico, se tiñeron las muestras de espermatozoides simultáneamente con merocianina 540 (M540) y Yo-Pro 1 (YP1) siguiendo el protocolo descrito por Harrison et al. (Harrison et al., 1996). Tanto en la especie bovina como en la porcina pudimos observar que la incubación de los espermatozoides con PLG o con PLA durante 30 minutos no tenía ningún efecto perjudicial sobre los tres parámetros evaluados, por lo que la disminución de la penetración y de la unión a la ZP no podía justificarse por fallos en la funcionalidad espermática. Finalmente, realizamos un ensayo de unión espermatozoide-ZP empleando zonas pelúcidas aisladas de vaca y cerda y espermatozoides de toro y verraco, respectivamente. Pudimos comprobar que la PLA, añadida al medio de cultivo 30 minutos después del inicio del mismo, provocaba la liberación de los espermatozoides que, antes de añadirla, se habían unido a la ZP en ambas especies. Este resultado nos llevó a la conclusión de que el mecanismo por el cual la PLA provocaba el efecto observado en la fecundación consistía en la rotura de las uniones espermatozoide-ZP previamente establecidas, conclusión que pudimos corroborar empleando un sistema de observación videomicroscópica en tiempo real. Mediante este sistema, comprobamos que, en ovocitos control, era prácticamente imposible separar de la ZP los espermatozoides que estaban firmemente unidos a ella. Sin embargo, cuando se vertía una solución de PLA en las proximidades de estos mismos espermatozoides, un ligero contacto con la pipeta de microinyección los desprendía de su unión a la ZP. El conjunto de evidencias experimentales obtenidas en el presente estudio junto a las referencias bibliográficas consultadas nos permitió proponer un modelo biológico para explicar el papel del sistema PLG-PLA en la fecundación. Este modelo supone que, ante la llegada de los primeros espermatozoides a la ZP, la activación del PLG de esta microrregión y su posterior conversión en PLA facilitaría, mediante proteolisis focalizada, el paso de los espermatozoides que llegaran más tarde a través de la zona. En este sentido, el sistema PLG-PLA facilitaría el proceso de fecundación. Sin embargo, el contacto del primer espermatozoide con el oolema provocaría una descarga masiva de activadores de PLG procedentes del ovocito que, tras la correspondiente generación de PLA, provocarían la rotura de las uniones espermatozoide-ZP ya establecidas, disminuyendo de este modo la entrada de espermatozoides adicionales al espacio perivitelino. Mediante este segundo mecanismo, por tanto, el papel del sistema PLG-PLA en la fecundación estaría relacionado con la regulación de la polispermia. La identificación de los lugares específicos de corte para la PLA que mediarían uno y otro efecto, así como de los activadores concretos implicados en cada proceso constituiría el objeto de futuras investigaciones.